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引物设计原则

2011/08/19, 浏览

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA
序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.
引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度(primer length)常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3.
引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72
GC
含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm5~10。若按公式Tm= 4G+C+2A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm55~80,其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。

4.
引物3′端不能选择A,最好选择T
引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,GC错配的引发效率介于AT之间,所以3′端最好选择T

5.
碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发(False priming)。降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的GC,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

6.
引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体(DimerCross dimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其
G值不要过高(应小于4.5kcal/mol)。否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

7.
引物5′ 端和中间
G值应该相对较高,而3′ G值较低。

G值是指DNA 双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,G值越大,则双链越稳定。应当选用5′ 端和中间G值相对较高,而3′ G值较低(绝对值不超过9)的引物。引物3′ 端的G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。(不同位置的G值可以用Oligo 6软件进行分析)

8.
引物的5′端可以修饰,而3′端不可修饰。
引物的5′ 端决定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′ 端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。

引物的延伸是从3′ 端开始的,不能进行任何修饰。3′ 端也不能有形成任何二级结构可能。

9.
引物应具有特异性。
引物设计完成以后,应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了。

值得一提的是,各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难,例如GC含量偏高或偏低,导致找不到各种指标都十分合适的引物;用作克隆目的的PCR,因为产物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次,尽量去满足条件。做Real Time,用于SYBR Green I法时的一对引物与一般PCR的引物,在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求:

1)
避免重复碱基,尤其是
G.
2)Tm=58-60
度。

3
GC=30-80%.
4)3'
端最后5个碱基内不能有多于2个的G
C.
5)
正向引物与探针离得越近越好,但不能重叠。

6)PCR
扩增产物长度: 引物的产物大小不要太大,一般在80-250bp之间都可;80150 bp最为合适(可以延长至300 bp)。

7)
引物的退火温度要高,一般要在60度以上;

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。

而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力,即引物应该跨外显子,最好是引物能跨外显子的接头区,这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。