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引物设计原则

2011/08/19, 浏览

1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA
序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.
引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度(primer length)常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74,不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

3.
引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72
GC
含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm5~10。若按公式Tm= 4G+C+2A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm55~80,其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。

4.
引物3′端不能选择A,最好选择T
引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,GC错配的引发效率介于AT之间,所以3′端最好选择T

5.
碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发(False priming)。降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的GC,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

6.
引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体(DimerCross dimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其
G值不要过高(应小于4.5kcal/mol)。否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。

7.
引物5′ 端和中间
G值应该相对较高,而3′ G值较低。

G值是指DNA 双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,